Ⅲ. 研究教育活動

1. 研究部門及び附属施設

神経科学研究部門

統合脳システム分野

＜研究概要＞

A) ウイルスベクターシステムを駆使した線条体入力系の構造―機能連関の解明
高田昌彦, 井上謙一
　本研究では、さまざまなウイルスベクターを利用した先端的神経ネットワーク解析システムを確立し、それらを駆使して、霊長類の大脳基底核を巡る神経ネットワークの構造と機能を明らかにすることを目的としている。平成27年度は、まず前年度から進めてきた「高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質―線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング」に関する研究計画を継続している。新規に導入したデジタルスライド解析装置を用いて、４種類の蛍光蛋白質をそれぞれ発現する狂犬病ウイルスベクターを異なる前頭前野領域に注入したマカクザルにおいて、二次および三次ニューロンとして各蛍光蛋白質でラベルされた淡蒼球内節・黒質網様部ニューロンあるいは線条体ニューロンの分布、および複数の蛍光蛋白質で多重ラベルされた単一ニューロンの分布を解析している。また、「線条体の特定の部位に入力するニューロンの入出力解析法の確立」についても、前年度から進めてきたマーカー蛋白質のリーク発現を低減した逆行性感染型レンチウイルスベクターとアデノ随伴ウイルスベクターを組み合わせた遺伝子改変サルモデルの作製に関する研究計画を継続している。「線条体の特定の部位に入力する視床および黒質のニューロン群の入出力解析」については、上記と同様の入出力解析法により、遺伝子改変サルモデルの作製に関する研究計画を進めている。当該研究成果に基づき、「視床、黒質、前頭葉皮質から線条体の特定の部位に入力する神経路に対する機能介入」について、Tet-On発現制御法を用いた神経路選択的開口放出阻害により、テトラサイクリン応答配列の下流にテタヌストキシン軽鎖遺伝子を組み込んだ逆行性感染型レンチウイルスベクターを線条体に、改変逆テトラサイクリンアクチベータを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを黒質に注入してパーキンソン病サルモデルを作製し、行動障害のパターンを解析することを検討している。

B) サル脊髄損傷モデルを用いた代償性神経回路再編メカニズムの解明
高田昌彦, 中川　浩
本研究では、脊髄損傷後の機能回復と神経回路再編のメカニズムを明らかにするため、解剖学的（皮質脊髄路の直接路が存在する）および生理学的（手指の巧緻性が発達している）にヒトに近縁のマカクザルを用いて、脊髄損傷後に起こる皮質脊髄路の代償性変化を同定し、運動機能回復との相関を解析することを目的とする。平成27年度は、研究実施計画に記載した（１）サル脊髄損傷モデルの作製、（２）脊髄損傷後の運動機能の解析、（３）脊髄における代償性神経回路の形成様式の解析、（４）代償性神経回路の機能回復への寄与の検証、のすべての研究計画を実施した。主な研究実績は以下のとおりである。
（１）サル脊髄損傷モデルの作製：マカクザルを用いて、頸髄下部（C7/8レベル）において片側2/3（内側部を除く）を傷害した脊髄損傷モデルを作製した。
（２）脊髄損傷後の運動機能の解析：脊髄損傷後、自然経過に伴う運動機能の回復過程を、手指の巧緻運動能力を定量的に評価できるBrinkman board testとreaching/grasping taskを用いて解析した。
（３）脊髄における代償性神経回路の形成様式の解析：運動機能の回復がみられた後、脊髄において代償性の皮質脊髄路がどのように再編しているかを明らかにするため、皮質脊髄路線維の脊髄内再分布様式を順行性神経トレーシングにより解析した。その結果、皮質脊髄路線維のうち運動ニューロンが分布する9層に分布する割合が、対照群に比べて顕著に増大していることがわかった。
（４）代償性神経回路の機能回復への寄与の検証：脊髄損傷側と反対側の一次運動野の手指領域を皮質内微小刺激によって刺激し、運動が惹起されることを確認した後、同定した領域にmuscimolを注入し、運動機能の解析をおこなった。その結果、muscimol注入により手指運動が麻痺することが確認された。

C) サルモデルによる皮質脊髄路の可塑性制御機構の検討
高田昌彦, 中川　浩, 二宮太平, 大石高生
① 霊長類（サルおよびヒト）での脳または脊髄障害後の皮質脊髄路の可塑性制御機構の解明
「脊髄損傷サルモデルにおける皮質脊髄路の可塑的変化の解析」では、脊髄損傷からの機能回復に関わる皮質脊髄路線維連絡の代償性変化を、サルを用いた順行性神経路トレーシングにより明らかにした。具体的には、頸髄下部（C7/8レベル）において片側2/3（内側部を除く）を傷害した脊髄損傷サルモデルを作製し、損傷後、自然経過に伴う運動機能の回復過程を、特に精密把持による手指の巧緻性を定量的に評価できるreaching/grasping taskを用いて解析するとともに、一次運動野（反対側）からの皮質脊髄路線維が脊髄内でどのように再分布しているかを解析した。その結果、損傷後、自然経過に伴い運動機能の回復が認められ、皮質脊髄路線維の脊髄内分布については、一次運動野由来の線維のうち脊髄運動ニューロンが局在する9層に分布するものの割合が、健常個体に比べて著しく増加していることが検証された。本研究成果を原著論文として発表した。また、「脊髄損傷サルモデルを用いたリハビリテーションの効果の検討」では、狂犬病ウイルスを用いた逆行性越シナプス的神経トレーシングにより、脊髄損傷サルモデルにおいて残存している皮質脊髄路、いわゆる間接路の構築を調べた。損傷直後に同側の脊髄に狂犬病ウイルスを注入した例では、反対側の一次運動野に限局して越シナプス的ニューロンラベルが観察された。このことから、一次運動野だけでなく運動前野や補足運動野からの出力を中継する直接路とは異なり、間接路は一次運動野からの出力のみを中継することが明らかになった。また、機能回復した後に損傷側と同側の脊髄に狂犬病ウイルスを注入した例では、両側の一次運動野に越シナプス的ニューロンラベルが観察された。このことは、リハビリテーションによる機能回復に損傷側と同側の一次運動野が関与する神経回路の再編成が寄与することを示唆している。
② 脳障害後の神経回路の修復を促進する治療法の開発的研究
RGM抗体投与群、対照群ともに３頭ずつのサルにおいて、Brinkman board testとreaching/grasping taskを用いた行動学的評価を実施し、RGM抗体投与による効果を検証した。その結果、いずれの行動学的解析においても、対象群と比較してRGM抗体投与群で運動機能回復が顕著に認められた。特に、RGM抗体投与群では精密把持が認められるようになっていた。このことは、RGM抗体投与により、手指の巧緻性の回復が促進されたことを示している。さらに、BDAを用いた皮質脊髄路の順行性神経路トレーシングによって、RGM抗体投与群では損傷部位よりも尾側の脊髄レベルまで多くの神経線維が伸長していることが明らかになった。

D) 霊長類の大脳―小脳―基底核ネットワークにおける運動情報処理の分散と統合
高田昌彦, 井上謙一, 二宮太平
① 狂犬病ウイルスを用いた解析【構造解析】
　逆行性越シナプス的感染能を有し、４種類の異なる蛍光蛋白を発現する狂犬病ウイルスベクターを用いて、大脳皮質-大脳基底核ループ回路、大脳皮質-小脳ループ回路、および大脳基底核と小脳を繋ぐ神経回路の基本的枠組みを明らかにすることが目的である。平成27年度は、本CREST研究の支援により開発に成功したベクターの更なる改良をおこない、特にサル脳における逆行性越シナプス的多重トレーシングの最適化を図った。現在、複数の皮質領野に入力する多シナプス性ネットワークの構築様式を単一サル個体で解析するため、４種類のベクターを前頭前野の異なる４つの領野に注入し、大脳基底核と小脳における標識ニューロンの分布を解析しており、当初設定したマイルストーンを十分達成していると考える。
② 神経路選択的操作モデルサルの作製【介入解析】
　マウスIL-2受容体を発現するウイルスベクターを脳内に注入し、この遺伝子を発現する神経路を新型イムノトキシンで除去する実験系を確立することが目的である。なお、本項目は、小林グループと共同で実施する。平成27年度は、小林グループが新型イムノトキシンの開発に成功するまでの時間を利用して、逆行性感染型レンチウイルス（LV）ベクターとアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターとの二重感染、およびテトラサイクリン誘導性発現制御システムを利用して、特定の神経路を構成するニューロンでのみドキシサイクリン依存的に神経伝達阻害が起こるような神経路選択的遺伝子操作法を、サルの黒質線条体路において確立した。具体的には、テトラサイクリン応答因子制御下にテタヌストシキン軽鎖フラグメントおよびGFP遺伝子を搭載したLVベクターを線条体に、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子を発現するAAVベクターを黒質に注入したサルにおいて、ドキシサイクリンの経口投与により、パーキンソン病様の運動症状がみとめられた。このような症状は投与を中止すると消失し、再び投与を開始すると発現した。当初設定したマイルストーンとは異なるものの、関連する神経路選択的操作モデルサルの作製に成功しており、十分な成果が得られていると考える。
③ 神経路選択的操作モデルサルの機能解析【介入解析】
　テトラサイクリン依存的にテタヌストキシンを発現させることにより、大脳皮質間の投射を選択的かつ可逆性に遮断し、当該神経路の機能的役割を明らかにすることが目的である。なお、本項目は、星、小林、南部グループと共同で実施する。平成27年度は、実際に一次体性感覚野から一次運動野への投射を当該手法を用いて神経路選択的に遮断したモデルサルを作製し、行動学的および電気生理学的変化を解析したが、顕著な変化は認められなかった。現在、異なる手法によるアプローチを試みており、当初設定したマイルストーンを十分達成しているとは言えないが、平成28年度における研究計画の遂行に向けて十分な成果が得られていると考える。

E) マーモセットの高次脳機能マップの作成および研究環境の提供
高田昌彦, 上園志織, 井上謙一, 大石高生
① マーモセットの大脳を巡る多シナプス性神経回路の解析
　前年度に新規導入した小型動物MRI装置によるマーモセット脳MRI撮像法の確立、P2Aレベル実験室におけるマーモセット脳への狂犬病ウイルスベクター注入および実験個体飼育のためのセットアップ、前年度に新規導入したデジタルスライド解析装置によるマーモセット脳組織標本の画像取得プロトコルの確立と解析方法の検討をおこない、狂犬病ウイルスベクターを用いたin vivoレベルでの一連の研究態勢を立ち上げた。
② 疾患／病態モデルマーモセットの作出
　技術開発個別課題を担当する福島県立医科大学の小林和人教授との連携により、前年度に開発し、マカクザル脳で高い逆行性感染能を示したNeuRet（FuG-E型）ベクターとHiRet（FuG-B2型）ベクターのマーモセット脳における外来遺伝子の導入効率を比較、検討するため、線条体および大脳皮質への注入実験をおこない、特に線条体注入例について組織学的解析を進めた。また、パーキンソン病モデルマーモセットの行動評価を実施するために階段採餌課題装置、運動機能評価タスク、および装着型活動量連続計測装置を開発した。さらに、黒質ドーパミンニューロン選択的にアルファシヌクレインを発現するアデノ随伴ウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの開発と、黒質線条体ドーパミン神経路選択的に神経伝達を阻害するためのTet-ONシステムを用いた遺伝子操作ベクターシステムの改良をおこなった。

F) 実行機能の脳内メカニズムの研究
大石高生，宮地重弘（高次脳機能），泉明宏（武蔵野大）
物体認識、空間認識のそれぞれに関するワーキングメモリーが必要な行動課題を訓練し、ドキシサイクリン投与依存的に特定のシナプス伝達を抑制するためのベクター注入を前頭前野背外側部に行ったアカゲザルで、ドキシサイクリンを投与して課題を行わせた後に課題関連細胞を検出するため、Fos, Zif268の発現細胞の分布を検討した。

G) 早老症様症状自然発症の難病と考えられるニホンザルに関する研究
大石高生，高田昌彦，今井啓雄（遺伝子情報），平井啓久（遺伝子情報），今村公紀（遺伝子情報），釜中慶朗（人類進化モデル研究センター），森本真弓（人類進化モデル研究センター），兼子明久（人類進化モデル研究センター），宮部貴子（人類進化モデル研究センター），橋本直子（人類進化モデル研究センター），平崎鋭矢（進化形態），木下こづえ（細胞生理），郷康弘（自然科学研究機構），東超（奈良県立医大）
早老症様の症状を示したニホンザルに関して、組織の元素分析を行った。腎臓や肝臓、心臓で必須微量元素の減少が観察された。顔貌と骨格に異常の見られる若桜群のサルの家系に関して、血液、尿、骨格、行動の検査を行い、まれな遺伝病が示唆される予備的結果を得た。

H) サル脊髄損傷モデルにおける運動ニューロンの可塑的変化による機能回復機序の解明
中川浩
片側２/３脊髄損傷モデル（頸髄領域）を用いて、約３か月間にわたり経時的な手指の運動機能変化を解析した。その結果、損傷直後は著しい機能低下を認めたが、約４週後より徐々に機能回復が見られた。この結果は、霊長類においても運動機能を代償するための神経可塑性変化が生じていることを示唆している。次に、運動ニューロンスパインの可視化の検討を行った。運動ニューロンスパインの可視化には、当初逆行性ウイルスベクター（GFP導入）を用いることを検討していたが、この方法では運動ニューロンのスパインを詳細に解析することが困難であることが分かった。そこで、ゴルジ染色法に変更し検討を行い、予備的な結果を得た。

＜研究業績＞

原著論文

1) Chung G, Saito M, Kawano T, Lee S, Takada M, Bae Y.C, Oh S.B, Kang Y (2015) Generation of resonance-dependent oscillation by mGluR-I activation switches single spiking to bursting in mesencephalic trigeminal sensory neurons. Eur J Neurosci,41,998-1012.

2) Dougherty K, Cox MA, Ninomiya T, Leopold DA, Maier A (2015)"Ongoing alpha activity in V1 regulates visually driven spiking responses" Cerebral Cortex In press.

3) Inoue K, Takada M, Matsumoto M (2015) Neuronal and behavioural modulations by pathway-selective optogenetic stimulation of the primate oculomotor system. Nature communications,6,8378.

4) Ishida H, Inoue K, Takada M, Hoshi E (2016) Origins of multisynaptic projections from the basal ganglia to the forelimb region of the ventral premotor cortex in macaque monkeys. European Journal of Neuroscience,43,2,258-269.

5) Ito T, Inoue K, Takada M (2015) Distributions of glutamatergic, GABAergic, and glycinergic neurons in the auditory pathways of macaque monkeys. Neuroscience,310,128-151.

6) Kawai T, Yamada H, Sato N, Takada M, Matsumoto M (2015) Roles of the lateral habenula and anterior cingulate cortex in negative outcome monitoring and behavioral adjustment in nonhuman primates. Neuron,88,792-804.

7) Kobayashi Kenta, Kato Shigeki, Inoue Ken-ichi, Takada Masahiko, Kobayashi Kazuto, Manfredsson FP (2016) Altering Entry Site Preference of Lentiviral Vectors into Neuronal Cells by Pseudotyping with Envelope Glycoproteins Methods in molecular biology,1382,175-186.

8) McCairn KW, Nagai Y, Hori Y, Ninomiya T, Kikuchi E, Lee J-Y, Suhara T, Iriki A, Minamimoto T, Takada M, Isoda M, Matsumoto M (2016) A primary role for nucleus accumbens and related limbic network in vocal tics. Neuron,89,300-307.

9) Murata Y, Higo N, Oishi T, Isa T. (2015) Increased expression of the growth-associated protein-43 gene after primary motor cortex lesion in macaque monkeys. Neuroscience Research,98,64-69.

10) Nakagawa H, Ninomiya T, Yamashita T, Takada M (2015) Reorganization of corticospinal tract fibers after spinal cord injury in adult macaques. Sci Rep,5,11986.

11) Sasaki KS, Kimura R, Ninomiya T, Tabuchi Y, Tanaka H, Fukui M, Asada YC, Arai T, Inagaki M, Nakazono T, Baba M, Kato D, Nishimoto S, Sanada TM, Tani T, Imamura K, Tanaka T, Ohzawa I. (2015)"Supranormal orientation selectivity of visual neurons in orientation-restricted animals" Scientific Reports 5, 16712

著書

1) 高田昌彦 (2015)「脳神経外科医が知っておくべきニューロサイエンスの知識」. 文光堂.

2) 高田昌彦 (2015) Clinical Neuroscience「メインテーマ　脳の見える化─構造編　伝導路を見る」. 中外医学社.

3) 川合隆嗣、山田洋、佐藤暢哉、高田昌彦、松本正幸 (2015) 生体の科学「特集　脳と心の謎はどこまで解けたか」. 医学書院.

4) 大石高生 (2015)「脳神経外科医が知っておくべきニューロサイエンスの知識」. 文光堂.

学会発表

1) Nakagawa H, Yamashita T, Takada M (2016) Reorganization of corticospinal tract fibers in a primate model for spinal cord injury.International Symposium on Adaptive Circuit Shift 2016（2016/03/03-04, 京都）.

2) Inoue K, Takada M, Matsumoto M (2016) Neuronal and behavioral modulations by pathway-selective optogenetic stimulation of the primate oculomotor system.International Symposium on Adaptive Circuit Shift 2016（2016/03/03-04, 京都）.

3) Ogasawara T, Takada M, Matsumoto M (2015) Midbrain dopamine neurons signal whether planned eye movements are successfully.Neuroscience 2015 (2015/10/18-21, Chicago, USA).

4) K.W.McCairn, Nagai Y, Kimura K, Go Y, Inoue K, Isoda M, Minamimoto T, Matsumoto M, Ninomiya T, Takada M (2015) Spontaneously emerging Parkinsonism-cerebellar syndrome in a subspecies of japanese macaque (macaca fuscata yakui): a potential analogue of multiple system atrophy.Neuroscience　2015（2015/10/18-21, Chicago, USA）.

5) Nakagawa H, Ninomiya T, Yamashita T, Takada M (2015) The pattern of reinnervation of sprouting corticospinal tract fibers after spinal cord injury in macaques.Neuroscience　2015（2015/10/18-21, Chicago, USA）.

6) Ninomiya T, Hoshi E, Takada M (2015) Layer-specific inputs from the supplementary motor area and the dorsal premotor cortex to the primary motor cortex in macaques.Neuroscience　2015（2015/10/18-21, Chicago, USA）.

7) Inoue K, Takada M, Matsumoto M (2015) Optogenetic stimulation of the pathway from the frontal eye field to the superior colliculus evokes neuronal and behavioral modulations in monkeys.Neuroscience　2015（2015/10/18-21, Chicago, USA）.

8) Kawai T, Yamada H, Sato N, Takada M, Matsumoto M (2015) Outcome monitoring and behavioral adjustment by putative pyramidal neurons and interneurons in the primate anterior cingulate cortex during a reversal learning task. Neuroscience　2015（2015/10/18-21, Chicago, USA）.

9) Yasukochi R, Inoue K, Takada M (2015) Development in a novel maze-task device for macaques to explore the neural mechanisms underlying motor skill learning.Neuroscience　2015（2015/10/18-21, Chicago, USA）.

10) Takada M, Inoue K, Miyachi S (2015) Recruitment of calbindin into nigral dopaminergic neurons prevents from MPTP-induced parkinsonism. 2nd World Congress on NeuroTherapeutics (2015/09/03-06, Prague, Czech Republic).

11) Takada M (2015) Protection against MPTP-induced parkinsonianinsults by calbindin recruitment into nigrostriatal dopamine neurons using recombinant viral vectors.第21回日本遺伝子治療学会学術集会（2015/07/26,大阪）.

12) Ogasawara T, Takada M, Matsumoto M (2015) Role of dopamine signals in response inhibition.第38回日本神経科学大会（2015/07/28,神戸）.

13) Yasukochi R, Inoue K, Takada M (2015) Development of a novel device for elucidating the neural mechanisms of motor skill learning in macaques.第38回日本神経科学大会（2015/07/29,神戸）.

14) Nakagawa H, Ninomiya T, Yamashita T, Takada M (2015) Reinnervation of corticospinal tract fibers after spinal cord injury in macaques.第38回日本神経科学大会（2015/07/29,神戸）.

15) Inoue K, Fujiwara M, Yasukochi R, Nagaya K, Takada M, Matsumoto M (2015) Oculomotor manipulations by pathway-selective optogenetics in nonhuman primates.第38回日本神経科学大会（2015/07/29,神戸）.

16) Ishida H, Inoue K, Takada M, Hoshi E (2015) Origins of multisynaptic projections from the basal ganglia to the ventral premotor cortex in macaque monkeys.第38回日本神経科学大会（2015/07/30,神戸）.

17) Chiken S, Takada M, Nambu A (2015) Abnormal information flow through the cortico-basal ganglia circuits in MPTP-treated parkinsonian monkeys.第38回日本神経科学大会（2015/07/30,神戸）.

18) K.W.MacCairn, Nagai Y, Hori Y, Kikuchi W, Auhara T, Minamimoto T, Iriki A, Takada M, Isoda M, Matsumoto M (2015) A comparative analysis of vocal and myoclonic tics in a monkey model of Tourette syndrome: a PET and electrophysiological study.第38回日本神経科学大会（2015/07/30,神戸）.

19) Nakagawa H，Ninomiya T，Yamashita T，Takada M (2015) Reorganization of corticospinal tract fibers after spinal cord injury in macaques.第50回日本理学療法学術大会（2015/06/05, 東京）.

20) 東超、大石高生、東野義之、東野勢津子、南武志、西真弓 (2016) サル輪状軟骨の元素蓄積の特徴.第121回日本解剖学会（郡山）.

21) 大石高生 (2015) 「早老症」モデルニホンザル、シワコについて.第12回NBR公開シンポジウム（2015/12/11東京）.

22) 郷康広、辰本将司、Qian Li、Liu He、大石高生、鵜殿俊史、重信秀治、柿田明美、那波宏之、Philipp Khaitovich (2015) ヒト脳と類人猿脳における時空間的比較トランスクリプトーム解析.日本進化学会　第17回大会 (2015/08/20, 東京).

講演

1) 井上謙一 (2015) Manipulation of primate neural networks by means of modified viral vectors. 5th NIPS-CIN Joint Symposium. 2015/11/5.

2) 高田昌彦 (2016) ウイルスベクターを用いた外来遺伝子導入による疾患モデル霊長類の開発. 都医学研セミナー.東京都医学総合研究所. 2016/3/18.

3) 高田昌彦 (2016) ウイルスベクターを用いた霊長類脳への外来遺伝子導入法とその応用. 新潟大学脳研究所-生理研合同シンポジウム.自然科学研究機構. 2016/3/1.

4) 高田昌彦 (2015) 遺伝子変異に基づく精神・神経疾患霊長類モデルの開発に向けて. 第6回脳表現型の分子メカニズム研究会、第10回IGC、第6回COCORO合同会議.脳表現型の分子メカニズム研究会. 2015/11/15.

5) 高田昌彦 (2015) 神経回路研究の変遷と今後の霊長類研究. 生理研研究会2015「行動システム脳科学の新展開」.生理学研究所. 2015/12/4.

6) 高田昌彦 (2016) 大脳基底核の出力系、特に脳幹への下降性出力の構築様式と機能的意義. 第14回ジストニア研究会.都立神経病院. 2016/1/17.

7) 高田昌彦 (2016) 大脳―小脳―基底核ネットワークの構造基盤の解明. 革新的先端研究開発支援事業AMED-CREST「脳神経回路の形成・動作原理の解明と制御技術の創出」研究開発領域　平成27年度領域会議.革新的先端研究開発支援事業　AMED-CREST. 2016/2/14

8) 大石高生 (2015) サルを用いた脳脊髄損傷からの運動機能回復の研究： 　神経ネットワークの機能と構造の変化. 学校法人青丹学園関西学研医療福祉学院. 2015/7/3.

9) 大石高生 (2015) 霊長類を用いた脳機能研究：人との違いと共通点. 第35回日本脳神経外科コングレス総会.日本脳神経外科コングレス. 2015/5/9.