細胞生理分野

2015年4月の研究所組織改編でゲノム細胞研究部門が発足し、ゲノム進化分野と細胞生理分野を置くこととなった。両分野は研究、教育、社会貢献等を、密接な協力のもとですすめている。
細胞生理分野に所属する教員は古賀（教授）、岡本（教授）、木下（助教）の３名である。岡本は、人類進化モデル研究センターの教員を兼任し、センター長も努めている。教員に加え、印藤（研究員）、佐藤（修士2年生）、榎元（技術補佐員）、澤村（事務補佐員）が当分野に所属している。
本分野では、遺伝子・細胞・個体を対象とした実験室での実験から、東南アジアなどのフィールドでの調査まで、幅広く研究を展開している。また、国内の動物園とも協同で希少霊長類の研究を行っている。本年度は、ヒト科（ヒト・ゴリラ・オランウータンなど）やテナガザル科（フクロテナガザル・シロテテナガザルなど）、マカク類（ニホンザルなど）や新世界ザル（マーモセット・ヨザルなど）を中心に、ゲノム全体の大規模な変遷、病原体との共進化、繁殖効率向上を目指した自然および人工繁殖に関わる研究を実施し、学会および論文発表を行った。

＜研究概要＞

A) セントロメア反復配列の分子進化
古賀章彦
セントロメアは染色体上の構造物であり、細胞分裂で染色分体の両極への移動を牽引する。一般にDNA成分として大量の縦列反復配列を含む。ただし、新しく生じるセントロメアで反復配列がなくても機能する例が知られており、反復配列の存在は必須ではないといえる。しかし、長く安定して存在するセントロメアでは反復配列を含むものが大多数であり、世代を超えた長時間のスケールで反復配列が何らかの貢献をなすものと考えられる。具体的にどのような貢献であるかを探るために、高次構造および CENP-B box についての解析をすすめた。それぞれにつき、結果を論文として公表した。
高次構造は、連続した反復単位のブロックが単位となり、その単位が縦列で繰り返す構造である。ヒト科のみにみられる現象であると長く考えられていたが、これがテナガザル科にも広く存在することを、昨年度までに報告していた。より一般的な現象であるとの推測が成り立つため、ヒト科からさらに遠い系統関係にある新世界ザルでの状況を、今年度は調べた。手始めにマーモセットを対象とし、明瞭な高次構造を見出した。一般的な現象であるとの推測の証明が前進した。
CENP-B box は、セントロメア反復配列に存在するモチーフであり、セントロメア形成に関与するタンパクが、DNAへの結合の際に認識する。同様にヒト科のみで、その存在が知られていた。そして同様に、広くみられる現象であるとの仮説を立てた。マーモセットで正確な塩基配列を調べて、明瞭な CENP-B box があることを証明した。仮説の証明に資することとなった。

B) 夜行性への適応に伴うゲノムの変遷
古賀章彦
真猿類（新世界ザル、旧世界ザル、ヒト科からなる分類群）は、例外が１つあるのみで、すべて昼行性である。ヨザル（漢字では夜猿）がその例外である。このため、真猿類の共通祖先は昼行性であって、ヨザルの系統のみで夜行性への移行が起こったと、広く考えられている。夜行性への適応の１つとしてヨザルの目では、レンズとしてはたらく水晶体に加え、視細胞にレンズ様の構造があり、弱い光を効率よく集めている。この細胞内レンズ様構造は、ヘテロクロマチンが核内で凝集することで形成されている。昨年度までに、ヨザルのゲノムに３種類のヘテロクロマチンがあることを報告していた。今年度は、このうちのどれがレンズ様構造の形成に関与するかを調べた。３種類のうちの２つは、他の新世界ザルにも見られる反復配列である。残りの１つである OwlRep は、ヨザルに大量にあるものの、他の新世界ザルにはないと推測されている。この OwlRep がレンズ様構造の本体となっているという結果を得た。今年度末の時点で、結果の確認をすすめている。完了後に論文として公表する予定である。

C) ニホンザル血小板減少症の発症・非発症機序の解明とマカク類のリスク評価法の開発
岡本宗裕、鈴木樹理、兼子明久、明里宏文、宮部貴子、その他の人類進化モデル研究センター教職員
近年、京大下霊長研および生理学研究所のニホンザル繁殖施設（以下生理研繁殖施設）において、原因不明の血小板減少症が流行し、多数のニホンザルが死亡した。我々は、疫学調査とニホンザルへの感染実験を行い、霊長研で発生したニホンザル血小板減少症の病因が、サルレトロウイルス4型であることを明らかにした。一方、生理研繁殖施設で発生した同症は、疫学調査の結果からサルレトロウイスル5型（以下SRV-5）との関連が強く示唆されていたが、病因の確定には至っていなかった。そこで、SRV-5のニホンザルへの感染実験を行い、SRV-5と同症の関連を調べた。発症個体から分離したSRV-5をin vitro培養し、2頭のニホンザルの静脈内および腹腔内に投与した。その結果、SRV-5ウイルスRNAは投与後8日目から確認され、その後実験終了までウイルス血症が持続した。血小板数は15日目まではほぼ正常値を維持していたが、それ以降培養ウイルスおよび感染性クローンを投与した各1頭で急激に減少し、24日目には1万以下となったため安楽殺した。また1頭は、22日目から血小板数が漸減し47日目には2万5千まで低下したが、その後回復し50日目以降はほぼ正常値で推移した。残りの1頭は、実験期間を通して血小板数の減少は認められなかった。そこで71日目より、生存中の2頭に対し免疫抑制剤としてデキサート2mg/kgを毎日筋肉内投与した。しかし、感染後100日まで血小板数の減少やその他の臨床症状は認められなかった。

D) 無鉤条虫・アジア条虫感染家畜の迅速検査法の開発と宿主特異性規定因子の探索
岡本宗裕
本研究の第一の目的は、ウシとブタにおける無鉤条虫・アジア条虫感染を高感度で検出可能な迅速検査法の開発である。開発途上国を中心に地球規模で蔓延する人獣共通感染症であるテニア症・嚢虫症を根絶するためには、患畜を簡便に検出できる信頼性の高い検査法が必須である。本研究の第二の目的は、近年その存在が明らかになった無鉤条虫とアジア条虫の交雑体について、感染様式を解明することである。2 種の交雑体がアジア各地に分布することが判明した現在、「無鉤条虫はウシ、アジア条虫はブタが中間宿主」という既成観念を取り払い、改めて家畜における両種ならびに交雑体の寄生状況を調査する必要がある。また、交雑体も含めた比較ゲノム解析により、両種の宿主特異性を規定する遺伝因子を探索する。
平成27年度は、タイの流行地において疫学調査を実施し、ブタおよびヒトからテニア属条虫を採取した。また、それらサンプルの遺伝子解析を実施した。

E) 有鉤条虫の撲滅を目指した流?調査と土壌伝播蠕虫の網羅的検出法の開発
岡本宗裕
本研究の目的は、発展途上国を中心に蔓延する風土病であり、致死率の高い有鉤嚢虫症の撲滅を目指した対策方法を確立することである。我々の十数年にわたる流行調査により、世界に先駆けて『中間宿主である有鉤嚢虫症患者・患畜と終宿主である有鉤嚢虫症患者が共住している希有な地域』が発見され、撲滅に向けた対策研究を実施できる段階となっている。本研究では、①有鉤嚢虫症の感染源である有鉤条虫症患者の迅速高感度な新規検出法の開発、②住環境の衛生度の指標である土壌伝搬蠕虫の網羅的検出法の開発、③それらを用いた流行調査を実施し、有鉤嚢虫と有鉤条虫の伝搬経路の解明を行い、『有鉤嚢虫症が風土病として定着している』要因を明確にすることにより、有鉤嚢虫症の撲滅を目指した対策方法を確立する。
平成27年度は、インドネシア･バリ島において疫学調査を実施し、ブタ血清を分離し、我々が開発した免疫診断法の有効性を確認した。フィールドでnaked-eye ELISAを実施することにより、効率よく有鉤条虫感染ブタを見つけることができた。一方で、胞状条虫との交差反応があることが明らかとなり、フィールドで使用するためにはさらなる精製が必要であることが明らかとなった。12月にタイ・バンコクで開催されたJITMM2014において、これまでの成果について、報告した。

F) 室内個別ケージ飼育下における雌ニホンザルの尿中性ステロイドホルモン濃度動態の把握
印藤頼子、佐藤 容、木下こづえ、岡本宗裕
ニホンザルは季節性多発情動物であり、秋から冬にかけての約6ヶ月間で発情し、繁殖を行うことが知られている。繁殖期の間は卵巣機能が活性化し、性ステロイドホルモンの分泌が促進される。またそれらのホルモン濃度は周期的な動きを示し、受胎の起こらなかった排卵周期の終わりには生理出血がみられる。人工授精や胚移植など、人工繁殖技術を成功させるためには、レシピエントの性周期と排卵のタイミングを正確に判定する必要がある。本研究では、室内飼育下の雌ニホンザルにおける性周期の特徴と傾向を、詳細に調べることを目的としている。今年度は秋から春にかけての尿中性ステロイドホルモン濃度動態を調べた。一般的にニホンザルの交尾期は9月から2月と知られているが、本研究の結果から、室内飼育下では約2ヶ月の遅れが生じていることが示唆された。さらに、性ステロイドホルモン濃度が低く周期性がみられないにもかかわらず生理出血を起こす個体も複数確認された。これらは、ホルモン濃度動態から正常な性周期によって引き起こされた生理出血ではなかったことが内分泌学的に示唆された。引き続き来年度の秋まで測定を継続し、通年でさらに詳細な性ステロイドホルモン濃度動態の把握を行う予定である。

G) 雌オランウータンの繁殖生理モニタリングに関する研究
木下こづえ、岡本宗裕、髙井 昭（神戸市立王子動物園）、佐野祐介（大阪市天王寺動植物公園）、清水美香（多摩動物公園）、大内章宏（旭川市旭山動物園）、村山美穂、伊谷原一（以上、京大・野生動物研究センター）尾崎康彦（名古屋市立大学産婦人科）
国内の複数の動物園（旭川市旭山動物園、多摩動物公園、よこはま動物園ズーラシア、大阪市天王寺動物園および神戸市立王子動物園）と共同で、正常出産または死産をした5例の雌オランウータンの尿中性ステロイドホルモンおよびロイシンアミノペプチダーゼ濃度測定を行い、本種の妊娠に関するバイオマーカーについて詳細に調べた。その結果、発情ホルモンの代謝産物であるエストロン-3-グルクロニドは、死産例において他の正常出産例と比較して有意に低濃度を推移していたことが判明した。また、有意性はないものの、胎盤の大きさに比例して分泌されるロイシンアミノペプチダーゼにおいても、死産した雌の場合は値が低く、同時に胎盤の大きさも他の正常出産例と比較して小さかったことが明らかとなった。これまでの研究成果を論文にまとめ、Jounarl of Medical Primatologyに投稿した。

H) 近赤外分光法を用いた雌オランウータンの新規発情モニタリング法の確立に関する研究
木下こづえ、Roumiana Tsenkova（神戸大学大学院農学研究科）
迅速および非破壊的に測定が可能な近赤外分光法を用いて、上記の雌オランウータンの尿について発情ホルモン濃度測定法の確立を行っている。平成27年度は、フィルターペーパーに尿を浸み込ませ、近赤外分光器を用いて拡散反射法により発情ホルモン代謝産物およびクレアチニン濃度の測定を試みた。その結果、従来法である酵素免疫測定法によって得られた値を用いて部分最小二乗法回帰分析を行った結果、高い相関係数が得られ、本手法による迅速なホルモン分析法の可能性が示された。本成果を論文にまとめPrimates誌に掲載された。また、野生動物に関する近赤外分光法の多様な応用例をCariie Vance博士らと共にまとめ、総説としてJounarl of Near Infrared Spectroscopyに掲載された。

I) ボルネオオランウータンの精子液状保存法および体内人工授精法の確立に関する研究
木下こづえ、尾崎康彦（名古屋市立大学大学院医学研究科）、久世濃子（国立科学博物館）、中村智行（千葉市動物公園）、宮川悦子（横浜市立金沢動物園）、小林智男（よこはま動物園ズーラシア）、尾形光昭（横浜市繁殖センター）　
千葉市動物公園およびよこはま動物園ズーラシアで飼育管理中の雄から無麻酔下で精液を採取し、ヒトまたはサル類で用いられている複数の精液希釈液および保存温度を試すことで、本種の最適な精液液状保存法の確立を行った。その結果、本種の精液は25℃の低温およびサル類の精液によく用いられているTTE保存液を用いた場合に、精子が長時間（30時間）生存することが明らかとなった。また、他の動物種において、通常保存に適していないと考えられている精液の凝固部に関して、本種の場合は凝固部の方が液状部よりも長く精子の運動性が持続することが判明した。これは、他の類人猿と比較して交尾機会が少ないこと、また樹上生活者であることに起因すると考えられた。本研究成果は来年度に執筆を行い、投稿を行う予定である。

J) 雌チンパンジーにおける授乳期間中の性ステロイドホルモン濃度動態に関する研究
木下こづえ、岡本宗裕、奥村文彦、星野智紀、廣澤麻里、坂口真悟、綿貫宏史朗、木村直人（以上、日本モンキーセンター）、伊谷原一、鵜殿俊史（以上、京大・野生動物研究センター）、市野悦子、高島友子、林 美里（以上、思考言語分野）
日本モンキーセンターにて飼育管理中の雌チンパンジー（マルコ）が2014年7月に雄を出産したが、出産後75日目より、授乳中にもかかわらず性皮の腫脹が観察され、交尾行動も確認された。そこで、授乳期間中の尿中発情ホルモン代謝産物および黄体ホルモン代謝産物濃度を測定し、過去に霊長類研究所で出産したアイ、パン、クロエの発情回帰時のホルモン濃度動態と比較を行った。その結果、霊長類研究所の3個体の発情ホルモンは、卵胞期と黄体期に濃度が上昇し二峰性を示していたのに対し、マルコの早期発情回帰時の黄体期の発情ホルモン濃度は低値を示し、二峰性の上昇は得られなかった。今後さらなる検証が必要であるが、マルコの早期発情回帰時は、何らかの理由で排卵が十分に引き起こされておらず、卵胞閉鎖が起こっていた可能性が考えられた。

＜研究業績＞

原著論文

1) B. Boufanaa, W. Lett, S. Lahmar, A. Griffiths, D.J. Jenkins, I. Buishi, S.A. Engliez, M.A. Alrefadi, A.A. Eljaki, F.M. Elmestiri, M.M. Reyes, S. Pointing, A. Al-Hindi, P.R. Torgerson, M. Okamoto and P.S. Craig (2015) Canine echinococcosis: genetic diversity of Echinococcus granulosus sensu stricto (s.s.) from definitive hosts. J. Helminthol,89,689-698. (July).

2) Kinoshita K, Tsenkova R (2015) Near infrared spectra of body fluids reveal the relationship between water spectral pattern and the oestrous cycle. NIR news,26,5,4-5.

3) Kugou K, Hirai H, Masumoto H, Koga A (2016) Formation of functional CENP-B boxes at diverse locations in repeat units of centromeric DNA in New World monkeys.（CENP-B box が新世界ザルではセントロメア反復配列の異なる多くの場所に生じている）. Scientific Reports,13,6,27833. (March).

4) Sujiwattanarat P, Thapana W, Srikulnath K, Hirai Y, Hirai H, Koga A (2015) Higher-order repeat structure in alpha satellite DNA occurs in New World monkeys and is not confined to hominoids（アルファサテライトＤＮＡの高次構造は新世界ザルにもありヒト上科に限定されない）. Scientific Reports,5,10315. (May).

5) Suntronpong A, Kugou K, Masumoto H, Srikulnath K, Ohshima K, Hirai H, Koga A (2016) CENP-B box, a nucleotide motif involved in centromere formation, occurs in a New World monkey（セントロメア形成に関与するシグナル CENP-B box が新世界ザルに存在する）. ,12,3,20150817. (August).

6) Yoshikawa Y, Okamoto M, Sakaguchi S, Nakagawa S, Miura T, Hirai H, Miyazawa T. (2015) Simian Retrovirus 4 Induces Lethal Acute Thrombocytopenia in Japanese Macaques.. Journal of Virology,89,7,3965-3975. (April).

7) 渡辺洋子、三觜 慶、石井奈穂美、名切幸枝、羽山伸一、中西せつ子、近江俊徳、岡本宗裕、浅川満彦 (2016) 青森県下北半島に生息するニホンザル（Macaca fuscata）の寄生蠕虫保有状況. 青森自然誌研究,21,87-90. (3月).

8) 木下こづえ (2015) ブータン南部ロイヤル・マナス国立公園の訪問を終えて―希少ネコ科動物の保全の現状について―. ヒマラヤ学誌,16,73-79.

著書

1) 木下こづえ(2015) 研究で動物園の動物と野生動物をつなぐ. どうぶつと動物園平成27年秋号.

その他執筆

1) 木下こづえ (2015) 幻のユキヒョウの姿をキャッチ！ 北白川書房.

学会発表

1) Koga A (2015) Higher-order repeat structure in centromere-region satellite DNA occurs in a wide range of primates. The 5th Asian Chromosome Colloquium. (April).

2) Suntronpong A, 久郷和人、舛本寛、平井啓久、古賀章彦 (2015) CENP-B box is likely yo confer a selective advantage on its host organism（CENP-B box はホストの長期的な生存に有利に作用することが考えられる）. 日本遺伝学会第８７回大会. (9月).

3) T. Miyabe-Nishiwaki, A. Kaneko, N. Suda-Hashimoto, Y. Indo, A. Ishigami, S. Aisu, A. Yamanaka, K. Nakamura, H. Akari, M. Okamoto, T. Fukui, K. Masui (2015) Hypnotic effects and pharmacokinetics of a single bolus dose of alfaxalone in Japanese macaques (Macaca fuscata). 12th World Congress of Veterinary Anaesthesiology. (9月).

4) 印藤頼子，奥村文彦，早川卓志，伊谷原一，岡本宗裕，木下こづえ (2016) チンパンジー（Pan troglodytes）における精子運動率の時間変化に関する基礎的研究. 第60回プリマーテス研究会. (1月).

5) 奥村文彦，星野智紀，坂口真悟，綿貫宏史朗，木下こづえ，岡部直樹，木村直人，伊谷原一 (2015) 飼育下チンパンジーの授乳期における性皮腫脹. 第31回日本霊長類学会大会. (7月).

6) 外丸祐介, 信清麻子, 吉岡みゆき，畠山照彦，印藤頼子，兼子明久，岡本宗裕，岡原純子，佐々木えりか (2015) 霊長類受精卵のガラス化保存. Cryopreservation Conference 2014. (10月).

7) 久世濃子，木下こづえ，宮川悦子，小林智男，尾形光昭，中村智行，黒鳥英俊，木村幸一，尾崎康彦 (2015) ボルネオオランウータン（Pongo pygmaeus）における精子運動率と時間変化に関する基礎的研究. 第31回日本霊長類学会大会. (7月).

8) 古賀 章彦,平井 啓久 (2015) 夜行性への移行に関与したと考えられるヨザルの大規模反復配列. 第31回日本霊長類学会大会. (7月).

9) 高野結衣, Gantigmaa Chuluunbaatar, Battulga Sumiya, Abmed Davaajav, Anu Davaasuren, 岡本宗裕, 柳田哲矢, 伊藤 亮, 浅川満彦 (2015) 2013 年に実施されたモンゴル国の野生イヌ科動物の寄生蠕虫相調査. 第21回日本野生動物医学会大会. (7月).

10) 篠﨑亜也子，百武真梨子，尾崎康彦，木下こづえ，柳井徳磨 (2016) 確定診断が困難であったボルネオオランウータンの腹腔内腫瘍の一例. 第22回動物園水族館獣医師臨床研究会. (2月).

11) 中村智行，尾崎康彦，木下こづえ，久世濃子，樽川修 (2015) オランウータンの人工授精への取り組み. 第63回全国動物園技術者研究会. (10月).

12) 尾崎康彦，木下こづえ，久世濃子，宮川悦子，中村智行，小林智男，尾形光昭 (2016) ボルネオオランウータン（Pongo pygmaeus）における精子液状保存方法の開発について. 「ず～だなも。」動物園大学6 in 犬山. (3月).

13) 木下こづえ，久世濃子，宮川悦子，小林智男，中村智行，尾形光昭，尾崎康彦 (2015) ボルネオオランウータン（Pongo pygmaeus）の精子液状保存法に関する基礎的研究. Support for African/Asian great Apes (SAGA) 18. (11月).

14) 木下こづえ，久世濃子，小林智男，宮川悦子，成田浩光，井上-村山美穂，伊谷原一，Roumiana Tsenkova (2015) フィルターペーパーを用いた近赤外分光法によるボルネオオランウータン（Pongo Pygmaeus）の尿中エストロゲン代謝産物濃度測定について. 第31回近赤外フォーラム. (11月).

15) 木下こづえ，久世濃子，小林智男，宮川悦子，成田浩光，井上-村山美穂，伊谷原一，Roumiana Tsenkova (2015) 近赤外分光法を用いたボルネオオランウータン（Pongo Pygmaeus）の尿中エストロゲン代謝産物とクレアチニン濃度測定について. 第31回日本霊長類学会大会. (7月).

16) 木下こづえ，高井 昭，佐野祐介，清水美香，林智男，大内章広，久世濃子，尾崎康彦 (2015) ボルネオオランウータン（Pongo pygmaeus）における正常出産および死産時の尿中性ステロイドホルモンおよび胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ濃度動態について. 第２０回日本病態プロテアーゼ学会学術集会. (8月).

17) 栁川洋二郎、杉本幸介、菅野智裕、高江州昇、印藤頼子、兼子明久、木下こづえ、今井啓雄、岡本宗裕、片桐成二、永野昌志 (2015) 凍結前精液の一時保存方法および冷却方法が融解後のマカク属精子の性状に与える影響. Cryopreservation Conference 2014. (10月).

講演

1) 木下こづえ (2016) 希少種の保全繁殖研究について. 第131回システム自然科学研究科セミナー.(3月).

2) 木下こづえ (2016) オランウータン（Pongo sp.）の繁殖生理に関する研究について. 第5回オランウータン倶楽部講演会.(2月).

3) 木下こづえ (2015) モンゴルにおける調査. ユキヒョウシンポジウム―動物園から野生まで―.(10月).

4) 木下こづえ (2015) 研究で動物園の動物と野生動物をつなぐ. 東京都多摩動物公園ネコ展講演会，日野. (5月).

5) 木下こづえ (2015) 動物園水族館と研究者で培う動物学研究－希少種における飼育下での保全繁殖研究を例に－. 第62回日本実験動物学会総会，京都. (5月).