Ⅲ. 研究教育活動

1. 研究部門及び附属施設

分子生理研究部門

統合脳システム分野

＜研究概要＞

A) ウイルスベクターシステムを駆使した線条体入力系の構造―機能連関の解明

高田昌彦, 井上謙一

　本研究では、さまざまなウイルスベクターを利用した先端的神経ネットワーク解析システムを確立し、それらを駆使して、霊長類の大脳基底核を巡る神経ネットワークの構造と機能を明らかにすることを目的としている。平成26年度は、まず「高発現型multi-color狂犬病ウイルスベクターを用いた前頭葉皮質への多シナプス性出力様式と皮質―線条体入力様式に基づく線条体の機能マッピング」において、前年度に開発した4種類の蛍光蛋白質をそれぞれ発現する狂犬病ウイルスベクターを、単一サル個体の異なる前頭前野領域に注入し、二次および三次ニューロンとして各蛍光蛋白質でラベルされた淡蒼球内節・黒質網様部ニューロンあるいは線条体ニューロンの分布、および複数の蛍光蛋白質で多重ラベルされたニューロンの分布を解析するとともに、アデノ随伴ウイルスベクターによる皮質領域からの順行性トレーシングを併用して、線条体への入力と線条体からの出力の局在関係を解析し、大脳皮質─大脳基底核ループ回路の基本的構築を明らかにする研究計画を進めている。また、「線条体の特定の部位に入力するニューロンの入出力解析法の確立」では、前年度に改良したマーカー蛋白質のリーク発現を低減した逆行性感染型レンチウイルスベクター(改変テトラサイクリン応答配列の下流にFLEX配列に挟まれた逆位の膜局在型蛍光蛋白質(pal-XFP1)遺伝子とシナプシンプロモータの下流にタグ遺伝子の2つの配列を組み込んだもの)を線条体に、Creリコンビナーゼ等の部位特異的組換え酵素と、flagタグを付加した改変テトラサイクリンアクチベータを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを黒質に注入したモデルザルを作製し、線条体に投射する黒質ニューロンで2種類のベクターの多重感染が成立し、pal-XFPの発現が誘導され軸索が可視化されることを確認する研究計画を進めている。

B) 霊長類脳において導入遺伝子発現をモニターするための生体イメージング法の開発

高田昌彦，井上謙一

本研究では、PETやMRIなどの生体イメージング法においてマーカーとなる遺伝子を利用し、霊長類の脳にウイルスベクターを用いて導入した外来遺伝子の発現状態をモニターする手法を確立することを第一の目的とする。また、この手法を、研究代表者らが最近開発した、特定の神経路を形成するニューロン群にのみ外来遺伝子を導入する神経路選択的遺伝子操作法に適用し、当該神経路の活動を操作する機能介入の影響を解析する際に、導入したターゲット遺伝子の発現状態をモニターすることによって、遺伝子導入の成否を事前に確認できる手段を提供することを第二の目的とする。さらに、これらの技術を発展させて、RNAi誘導による発現抑制系にも応用できる汎用的システムの構築を目指す。本研究の成果は、ターゲット遺伝子を発現する特定のニューロン群の効率的な生体イメージングを実現する手法として、広く遺伝子治療や再生医療の発展にも貢献できると考える。平成26年度は前年度に開発、改良したレポーターシステムおよびウイルスベクターシステムを利用して、神経路選択的遺伝子導入ベクターシステムへのレポーター遺伝子の導入と最適化を実施し、レポーター遺伝子による発現状態の確認と薬剤導入による特定の神経路への機能介入を同時に実現する実験系の構築に成功した。さらに、イメージング結果と行動学的および組織学的解析結果との相関を調べることにより、本研究で確立した特定のニューロン群におけるターゲット遺伝子発現の機能的生体イメージング手法の有用性が明らかになった。

C) サルモデルによる皮質脊髄路の可塑性制御機構の検討

高田昌彦, 二宮太平, 大石高生

本研究では、サルを用いて片側の外側皮質脊髄路(直接路)を損傷した脊髄損傷モデルを作製し、脊髄損傷からの機能回復に関わる皮質脊髄路線維連絡の代償性変化を、順行性神経路トレーシングにより明らかにした。具体的には、頸髄下部(C7/8レベル)において片側2/3(内側部を除く)を傷害した脊髄損傷モデルを作製し、損傷後、自然経過に伴う運動機能の回復過程を、手指の巧緻運動能力を定量的に評価できるBrinkman board testとreaching/grasping taskを用いて解析するとともに、運動機能の回復がみられた後、一次運動野(反対側)からの皮質脊髄路線維が脊髄内でどのように分布しているかを解析した。その結果、脊髄損傷モデルでは、健常個体に比べて、運動野由来の線維のうち脊髄運動ニューロンが局在する9層に分布するものの割合が著しく増大していることが明らかになった。

D) 霊長類の大脳―小脳―基底核ネットワークにおける運動情報処理の分散と統合

高田昌彦, 二宮太平, 井上謙一

・狂犬病ウイルスを用いた解析【構造解析】

　狂犬病ウイルスを用いた逆行性越シナプス的トレーシング法により、大脳皮質前頭葉(運動関連領野、前頭前野)と大脳基底核や小脳との間で形成されるネットワーク構築を明らかにすることが目的である。その際、同一個体で複数の皮質領野のネットワーク構築を解析するため、狂犬病ウイルスCVS-26株に4種類の異なる蛍光蛋白(緑、赤、青、赤外)を搭載した狂犬病ウイルスベクターを利用する。平成26年度は前年度に開発に成功した4種類のカラー狂犬病ウイルスベクターの改良をおこなった。具体的には、検出限界程度であった三次ニューロンにおける蛍光標識の強度を高めるとともに、4種類のベクターの逆行性伝搬速度を揃えることにより、サル脳における逆行性越シナプス的多重トレーシング法の最適化を図ることを目指した。現在、これらのベクターを前頭前野の異なる4領野に注入し、大脳基底核と小脳における標識ニューロンの分布を解析している。

・神経路選択的操作モデルサルの作製【介入解析】

　平成26年度は逆行性感染型レンチウイルス(LV)ベクターとアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターとの二重感染、およびテトラサイクリン誘導性発現制御システム(Tet-ON)を利用して、特定の神経路を構成するニューロンでのみドキシサイクリン依存的に神経伝達阻害が起こるような神経路選択的遺伝子操作法を、サルの黒質線条体神経路において確立した。具体的には、テトラサイクリン応答因子制御下にテタヌストシキン軽鎖フラグメントおよびGFP遺伝子を搭載したLVベクターを両側の線条体に、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子を発現するAAVベクターを両側の黒質に注入した。AAVベクターの注入後、約1ヶ月でドキシサイクリンの経口投与を開始し、自発運動や採餌タスクへの影響を調べた。その結果、ドキシサイクリンの投与により、前傾姿勢とバランス障害が顕著に確認され、また、採餌タスクにおいて巧緻運動の障害がみとめられた。このような症状はドキシサイクリンの投与を中止すると消失し、再び投与を開始すると発現した。現在、更なる行動解析をおこなうとともに、原著論文の作成を検討している。

・神経路選択的操作モデルサルの機能解析【介入解析】

　星グループの主導で進めている一次体性感覚野から一次運動野へのシナプス伝達を選択的にブロックする実験において、ウイルスベクターの提供と注入実験の協力をおこなった。しかしながら、期待した行動学的、電気生理学的変化が得られなかったため、原因について検討し、改良型の逆行性感染型レンチウイルスベクターを用いて再挑戦する予定である。

E) 運動障害と認知障害を切り分けるパーキンソン病のサーキットパソロジー

高田昌彦, 井上謙一

本研究では、独自に開発した逆行性感染型レンチウイルスベクター(逆行性LVベクター)とアデノ随伴ウイルスベクター(AAVベクター)を用いて、黒質ドーパミンニューロンに細胞死や興奮抑制を誘導するような機能分子を発現させ、ドーパミン神経路をその機能局在性に基づいて選択的に除去あるいは活動阻害することにより、運動障害と認知障害を分離することができるパーキンソン病の霊長類モデルを作出し、そのサーキットパソロジーを明らかにすることを目的としている。平成26年度は、以下の2つの研究計画を実施した。

　(1)運動機能と認知機能の評価を切り分けておこなうことができる新たな行動課題である迷路課題を考案し、この課題をサルにトレーニングした。

　(2)マカクザル脳におけるアルファシヌクレイン発現ニューロンの加齢による分布変化を、特に中脳ドーパミン神経系に着目して免疫組織化学的に解析した。本研究には、10歳から31歳(ヒトでは約30歳から93歳に相当)の健康なマカクザル(ニホンザル、カニクイザル、アカゲザル)を使用した。アルファシヌクレインの沈着は、黒質や腹側被蓋野のニューロンですでに10歳時からみとめられ、ドーパミン神経路に従って、その後、線条体と側坐核のニューロンにおいて亢進することが観察された。また、中脳皮質ドーパミン神経系におけるアルファシヌクレイン発現ニューロンは前頭前野領域、特に前部帯状皮質、前頭眼窩野、背外側前頭前野で加齢に伴って顕著になり、次第に運動関連領野へと波及した。本研究で用いたすべての個体において、パーキンソン病様の運動障害などの臨床症状を呈したものはなく、また、レビー小体様の凝集体形成も同定されなかった。本研究の結果から、老齢マカクザルはパーキンソン病だけでなく、びまん性レビー小体型認知症などのレビー小体に関連した精神・神経疾患の発症前モデルとして有用である可能性が示唆された。

F) 霊長類脳の転写因子遺伝子発現とその発達に関する研究

大石高生

髄鞘化の程度が低い状態で発現量が多い転写因子であるNEURODに関して、免疫組織化学的に発現細胞を調べた。小脳皮質では、プルキンエ細胞とバスケット細胞に顕著な発現が見られた。大脳皮質では、灰白質での発現は低く、白質のグリア細胞で顕著な発現が見られた。

G) 実行機能の脳内メカニズムの研究

大石高生，宮地重弘(高次脳機能)，泉明宏(武蔵野大)

物体認識、空間認識のそれぞれに関するワーキングメモリーが必要な行動課題を訓練し、ドキシサイクリン投与依存的に特定のシナプス伝達を抑制するためのベクター注入を前頭前野背外側部に行ったアカゲザルで、課題の学習成績におよぼすドキシサイクリン投与の影響が遅延時間の長短によってどう異なるかを検討した。

H) 早老症様症状を示したニホンザルに関する研究

大石高生，高田昌彦，今井啓雄(遺伝子情報)，平井啓久(遺伝子情報)，今村公紀(遺伝子情報)，釜中慶朗(人類進化モデル研究センター)，森本真弓(人類進化モデル研究センター)，郷康弘(自然科学研究機構)

幼弱期の両眼の白内障などの身体特徴を示したニホンザルに関して、生化学検査、脳形態計測、末梢神経生理検査、細胞培養などを行い、代謝障害や脳萎縮など、老化あるいはヒトの早老症と類似の症状が多数あることを確認した。遺伝子探索からは、ヒトの早老症原因遺伝子に問題がないことが判明し、異なる原因で起きた疾患であると考えられる。

I) サル脊髄損傷モデルにおける運動ニューロンの可塑的変化による機能回復機序の解明

中川浩

脊髄損傷などの中枢神経損傷により、神経細胞の変性，神経軸索の損傷が生じれば、神経回路が破綻し運動機能は失われる。その失われた機能は傷害後、一定の自然回復を示すことがある。この自然回復には、神経ネットワークの可塑的・代償的変化が寄与していることが推定されるが、そのメカニズムは未解明なままであった。本研究では脊髄損傷後の運動機能回復において、脊髄運動ニューロンスパインの可塑性変化が運動機能回復に寄与しているという仮説のもと検証を行っている。まず、はじめに脊髄損傷モデルを作成し、運動機能の回復過程を経時的に評価した。具体的には手指の運動機能を司る頸髄領域を損傷させ手指の運動麻痺を誘発した。その後、自然経過に伴う手指運動機能をReaching/grasping taskを用いて約3ヶ月間解析し、予備的な結果を得た。脊髄損傷後の運動機能を経時的に解析することにより、スパインを可視化する時期の検討を行うとともに自然経過によって運動機能が回復することを確認した。脊髄運動ニューロンスパインの可視化については、実験系の確立を進めている段階である。

＜研究業績＞

原著論文

1) Hiraoka M, Inoue K, Senoo H, Takada M (2015) Morphological study of the accommodative apparatus in the monkey eye. Anat Rec,298,630-636.

2) Murata Y, Higo N, Hayashi T, Nishimura Y, Sugiyama Y, Oishi T, Tsukada H, Isa T, Onoe H (2015) Temporal plasticity involved in recovery from manual dexterity deficit after motor cortex lesion in macaque monkeys. Journal of Neuroscience,35,1,84-95.

3) Oishi T, Imai H, Go Y, Imamura M, Hirai H, Takada M (2014) Sporadic premature aging in a Japanese monkey: a primate model for progeria. PLoS One,9,11,e111867.

4) Tohno Y, Tohno S, Oishi T, Minami T, Khanpetch P, Azuma C, Quiggins R (2014) Age-related decrease of the phosphorus content in the ligamentum capitis femoris of monkeys. Biological Trace Element Research,161,1,78-84.

著書(分担執筆)

1) 井上謙一、高田昌彦 (2014) Clinical Neuroscience「メインテーマ　脳のゆらぎ・同期・オシレーション」. 中外医学社.

著書

1) Takao Oishi (2015) Research into Japanese monkeys at the Primate Research Institute. Kyoto University.

2) Takao Oishi (2015) Too old for her age. Kyoto University.

学会発表

1) Nakagawa H, Ninomiya T, Yamashita T, Takada M (2015) Contribution of RGMa inhibition to recovery of motor functions after spinal cord injury in macaques.. 11th Goettingen Meeting of the German Neuroscience Society (2015/3/18-21, Goettingen, German).

2) Nakagawa H, Ninomiya T, Yamashita T, Takada M (2014) Enhanced functional recovery after spinal cord injury by inhibition of repulsive guidance molecule in macaques. VMT2014“Vision, Memory, Thought: how cognition emerges from neural network” (2014/12/6-7, 東京).

3) Kawai T, Yamada H, Sato N, Takada M, Matsumoto M (2014) Past outcome monitoring and subsequent behavioral adjustment in the primate lateral habenula and anterior cingulate cortex during a reversal learning task. VMT2014“Vision, Memory, Thought: how cognition emerges from neural network” (2014/12/6-7, 東京).

4) Inoue K, Kimura K, Yasukouchi R, Sugawara N, Okuda Y, Fujiwara M, Takada M (2014) Systemic delivery of an AAV vector in neonatal macaques results in widespread gene transduction into neurons throughout the brain. VMT2014“Vision, Memory, Thought: how cognition emerges from neural network” (2014/12/6-7, 東京).

5) Oishi T, Imai H, Go Y, Hirai H, Takada M (2014) Brain shrinkage and reduced nerve conduction velocity in a progeroid-like macaque monkey. Neuroscience 2014 (2014/11/15-19, Washington DC, USA).

6) Nakagawa H, Ninomiya T, Yamashita T, Takada M (2014) Effectiveness of inhibition of the repulsive guidance molecule, RGMa on the functional recovery following spinal cord injury in macaques. Neuroscience 2014 (2014/11/15-19, Washington DC, USA).

7) Nagai Y, Kikuchi E, W. Lerchner, Inoue K, Oh-nishi A, Kaneko H, Kato Y, Hori Y, B. Ji, Kumata K, M. Zhang , Aoki I, Suhara T, Takada M, Higuchi M, B. J. Richmond, Minamimoto T (2014) In vivo PET imaging of the behaviorally active designer receptor in macaque monkeys. Neuroscience 2014 (2014/11/15-19, Washington DC, USA).

8) Kang Y, Chung G, Saito M, Takada M, Bae Y, Kim J, Oh S (2014) Enhancement of INaP-mediated resonance by mGluR-I activation induces burst firing in mesencephalic trigeminal sensory neurons. Neuroscience 2014 (2014/11/15-19, Washington DC, USA).

9) K. W. McCairn, Nagai Y, Hori Y, Iriki A, Takada M, Minamimoto T, Isoda M, Matsumoto M (2014) Distinct cortical and subcortical networks drive myoclonic and vocal tics in the nonhuman primate model of Tourette syndrome: A PET and electrophysiological study. Neuroscience 2014 (2014/11/15-19, Washington DC, USA).

10) Inoue K, Kimura K, Yasukochi R, Sugawara N, Okuda Y, Fujiwara M, Takada M (2014) Intravascular administration of an AAV vector to neonatal macaques results in widespread gene transduction into neurons throughout the primate brain. Neuroscience 2014 (2014/11/15-19, Washington DC, USA).

11) 澤田真寛，吉野−斎藤紀美香，二宮太平，大石高生，山下俊英，高田昌彦，尾上浩隆，西村幸男，伊佐正 (2014) 脊髄損傷からの回復過程における皮質脊髄路の再編. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

12) 木村活生，井上謙一，田中章景，高田昌彦 (2014) マカクザル脳における加齢に伴うアミロイドβ蛋白の蓄積変化. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

13) 中川浩，二宮太平，高田昌彦，山下俊英 (2014) サル脊髄損傷後の運動機能回復と神経再生におけるRGMの役割. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

14) 大石高生，今井啓雄，郷康広，平井啓久，高田昌彦 (2014) ニホンザルが示した神経系等の早老症的症状. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

15) 川合隆嗣，山田洋，佐藤暢哉，高田昌彦，松本正幸 (2014) 報酬履歴と行動切替に関わる外側手綱核と前部帯状皮質の異なる神経表現. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

16) 金子将也，畑中伸彦，高良沙幸，高田昌彦，南部篤 (2014) 運動課題遂行中のサルにおける淡蒼球ニューロン活動のグルタミン酸およびGABA作動性調節. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

17) 永井裕司，菊池瑛理佳，Walter Lerchner，井上謙一，大西新，金子博之，加藤陽子，堀由紀子，季斌，熊田勝志，張明栄，青木伊知男，須原哲也，高田昌彦，樋口真人，Barry J Richmond，南本敬史 (2014) DREADDを用いたサルの行動制御とPET生体内イメージング. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

18) 井上謙一，木村活生，安河内竜二，菅原直也，小笠原宇弥，奥田泰弘，藤原真紀，高田昌彦 (2014) AAVベクターによる霊長類新生児への全脳的遺伝子導入. 第37回日本神経科学大会(2014/9/11-13, 横浜).

19) 中川浩，二宮太平，高田昌彦，山下俊英 (2014) 手指屈筋由来の運動ニューロン分布とサル脊髄損傷後の手指機能回復について. 第49回日本理学療法学術大会(2014/5/30-6/1, 横浜).

講演

1)井上謙一 (2015) Manipulation of primate neural networks by means of modified viral vectors. the 120th Annual Meeting of The Japanese Association of Anatomists, the 92nd Annual Meeting of The Physiological Society of Japan.

2) 高田昌彦 (2015) 経路選択的な神経回路操作技術のマーモセット脳機能研究への応用. 第4回マーモセット研究会.

3) 東超，大石高生，東野義之，東野勢津子，南武志 (2015) サル甲状軟骨の元素の加齢変化. 第120回日本解剖学会.

4) 高田昌彦 (2014) ウィルスベクターを用いた外来遺伝子導入による疾患モデル霊長類の開発. システム神経科学セミナー.

5) 高田昌彦 (2014) パーキンソン病モデルサルにおける大脳皮質−大脳基底核経路の情報伝達異常. 第39回日本大脳基底核研究会.

6) 井上謙一 (2014) ウイルスベクターを利用した霊長類遺伝子改変モデルの開発. 分子精神神経薬理学研究セミナー.

7) 高田昌彦 (2014) 狂犬病ウイルスを駆使した多シナプス性神経ネットワークの解析. 分子精神神経薬理学研究セミナー.

8) 高田昌彦 (2014) 黒質ドーパミン神経細胞への外来遺伝子導入によるパーキンソン病の予防的治療戦略. 第10回横浜パーキンソン病治療研究会.

9) 高田昌彦 (2014) 霊長類モデルを用いた今後の研究展開. ワークショップ「システム神経科学の将来展望」.

10) 大石高生 (2014) サルを用いた脳脊髄損傷からの運動機能回復の研究：脳内ネットワークの変化. 学校法人西丹学園関西学研医療福祉学院.